Grupo de INHIBIDORES

 

Inhibidores de Proteasas con aplicaciones Biomédicas y Biotecnológicas

El desarrollo de la Genómica y la Proteómica ha posibilitado la detección de nuevas dianas terapéuticas para el diseño u obtención de medicamentos con mecanismos de acción novedosos. Entre las más atractivas se encuentran las enzimas proteolíticas o proteasas que catalizan la ruptura de los enlaces que mantienen unidos los aminoácidos en las proteínas. El 2 % de los genes en la mayoría de los organismos codifica para estas enzimas y su actividad está involucrada en todo el ciclo de vida de un ser vivo. Estas funciones han determinado su selección como dianas terapéuticas en múltiples enfermedades sistémicas e infecciosas. Sus contrapartes moleculares, los inhibidores de proteasas (IP), constituyen reguladores endógenos de la actividad proteolítica, lo que les ha conferido aplicaciones novedosas como medicamentos y en el diagnóstico. Los IP pueden ser potencialmente utilizados en el tratamiento de enfermedades tan diversas como el cáncer y los desórdenes neurodegenerativos como el Alzheimer, las enfermedades inflamatorias, inmunológicas, respiratorias, cardiovasculares e infecciones parasitarias, fúngicas y virales entre las que se encuentran la malaria, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y la hepatitis, entre otros. La mayor fuente de medicamentos o de compuestos líderes para el desarrollo de fármacos contra éstas y otras enfermedades son los productos naturales, debido a su gran diversidad química. Los invertebrados marinos han sido la fuente seleccionada por el CEP para la identificación de IP por su abundancia, diversidad, hábitat excepcional y haber sido poco explorados desde el punto de vista molecular.

La estrategia seguida ha sido la identificación selectiva de los IP mediante una combinación de técnicas cinéticas tradicionales, con técnicas que se basan en su interacción con las proteasas dianas, en formatos de alta productividad y eficiencia, para el procesamiento de un gran número de muestras con alta resolución y especificidad. Entre las técnicas desarrolladas se encuentran los ensayos cinéticos, basados en los principios de la cinética de inhibidores de unión fuerte en lectores de placa, ensayos inmunoenzimáticos en fase heretogénea con sustrato incluido, los métodos de proteómica basados en la atenuación de la intensidad de la señal de espectrometría de masas (del inglés, intensity fading MALDI-TOF MS) y técnicas de biosensores, basadas en la resonancia superficial de plasmones (BIACORE o Iasys) (Gutiérrez et al, 2002; Salas et al, 2004, García- Fernández et al, 2009).

A lo anterior, se une el desarrollo de tecnologías de obtención por vía recombinante de proteasas dianas, lo que en su conjunto garantiza el primer paso de identificación y selección de los IP más prometedores. Se han desarrollado, además, tecnologías de inmovilización de estas proteasas que han permitido el diseño y la utilización de cromatografías de afinidad para la purificación de sus contrapartes, los IP, con el consecuente ahorro de recursos y tiempo (Ramírez et al, 2008, Gonzalez et al., 2007; Alonso del Rivero et al., 2012; del Monte et al., 2014). La caracterización funcional de los IP purificados se ha basado en el desarrollo de los métodos cinéticos de inhibición fuerte que han permitido la clasificación de los inhibidores sobre la base de su fortaleza de interacción con la proteasa diana y la determinación de parámetros cinéticos. La caracterización estructural se ha abordado mediante las técnicas ya establecidas para la determinación de la secuencia de aminoácidos y de la estructura tridimensional. En este último caso, se han utilizado técnicas de cristalización y bioinformáticas de modelación para la resolución de la estructuras por difracción de rayos X de los inhibidores libres y en complejos con sus proteasas diana (García Fernández et al., 2012; Alonso del Rivero et al., 2013; García Fernández et al., 2015). Por otra parte, los inhibidores se obtienen por vía recombinante para el diseño de mutantes que posibiliten, no solo comprender su mecanismos de inhibición y relaciones estructura-función, sino también poder obtener variantes de IP modificados con mejores propiedades o propiedades más direccionalizadas para su uso biomédico.

Esta dirección se agrupa en 4 temas diferentes atendiendo a la clase mecanística de la proteasa diana frente a la cual se desarrollan los inhibidores: proteasas de tipo serino y sus inhibidores, proteasas de tipo metalo y sus inhibidores, proteasas de tipo cisteíno y sus inhibidores y proteasas de tipo aspártico y sus inhibidores.

Entre los resultados más importantes se destacan el inhibidor aislado de la anémona S. helianthus (ShPI-1), obtenido actualmente por vía recombinante, que es una molécula con propiedades funcionales excepcionales por su capacidad de inhibir proteasas de tres clases mecanísticas (Chávez et al, 1988 Patente; Delfín et al, 1996; Gil et al., 2011). Este inhibidor se ha estudiado funcional y estructuralmente de manera extensiva y se conoce su estructura por RMN  y por difracción de rayos X, en su forma libre y en complejo con dos de sus proteasas dianas (García Fernández et al., 2011, 2012, 2015). La obtención de mutantes no solo ha complementado los estudios de estructura-función, sino también ha permitido la obtención de moléculas con propiedades funcionales modificadas. Todo ello ha determinado su inclusión en un ensayo inmunoenzimático para el diagnóstico precoz de la fibrosis quística, desarrollado por el Centro de Inmunoensayo (La Habana, Cuba) y su aplicación para disminuir la proteólisis e incrementar los rendimientos de proteínas obtenidas por vía recombinante expresadas en Pichia pastoris como es el caso de la miniproinsulina, precursor de la insulina (Gil et al., 2011).

Entre otros inhibidores importantes se encuentra el purificado a partir del molusco Cenchritis muricatus, que también representa un inhibidor excepcional desde el punto de vista estructural y funcional, capaz de inhibir fuertemente elastasa de neutrófilos humanos. Esta proteasa diana es la responsable de numerosas enfermedades respiratorias y pulmonares como el enfisema pulmonar, el distress respiratorio del adulto, entre otras, por lo que esta molécula tiene grandes potencialidades de aplicación en Biomedicina (González et al, 2005 Patente; González et al, 2007). Otro inhibidor con propiedades funcionales excepcionales es SmCI, aislado del anélido Sabellastarte magnifica, que constituye el único inhibidor descrito capaz de inhibir proteasas dianas de tipo serino como la tripsina y metalo exopeptidasas como las carboxipeptidasas (Alonso del Rivero et al., 2012). La estructura cristalográfica del complejo entre este inhibidor y la carboxipeptidasa A4 humana mostro un nuevo mecanismo de inhibición no canónico para esta enzima (Alonso del Rivero et al., 2013).

Otra estrategia iniciada en los últimos años es el tamizaje virtual con el empleo de herramientas bioinformáticas,de inhibidores de baja masa molecular de aminopeptidasas serino y metalo que se encuentran implicadas en procesos patológicos. Las moléculas identificadas frente a DPPIV y APN humanas, se han caracterizado por una baja toxicidad frente a células humanas normales y altos efectos citotóxicos en células cancerígenas humanas y muridas.

En la actualidad, los esfuerzos investigativos se están dirigiendo hacia la malaria, un problema de relevancia mundial. Esta enfermedad, que ocasiona más de un millón de muertes al año, es la principal causa de morbilidad y muerte en el mundo por lo que representa un problema de salud pública, especialmente en países en desarrollo. Factores como la resistencia del parásito a los medicamentos tradicionales, así como la baja sensibilidad del mosquito, su agente transmisor, a los insecticidas, ha determinado la reemergencia de la enfermedad y su extensión a otros países. Por estas razones, la Organización Mundial de la Salud ha lanzado un llamamiento para desarrollar medicamentos frente a nuevos blancos terapéuticos como las proteasas, involucradas en los procesos claves del desarrollo e infectividad del parásito (Domínguez et al, 2002, Salas et al.,2013  Gonzalez-Bacerio et al. 2014). La demostración experimental de que los inhibidores de estas proteasas inhiben el crecimiento del parásito, ha convertido a estas biomoléculas en agentes antimaláricos potenciales muy atractivos, sin embargo, los IP descritos tienen la desventaja de su baja efectividad y especificidad. Por otra parte, los enfoques terapéuticos tradicionales, en su inmensa mayoría, han confiado su efectividad a una única molécula, lo cual pudiera ser la causa de su inefectividad, dada la redundancia en los mecanismos fisiológicos del parásito para sortear la acción de la molécula inhibidora. De ahí que la propuesta del Centro se fundamente en la inhibición simultánea de diversas proteasas, considerando el sistema biológico integralmente. Actualmente, se han obtenido extractos prometedores frente a algunas de las proteasas que constituyen blancos terapéuticos, así como inhibidores que están en proceso de purificación y caracterización. Como parte de esta estrategia, se están obteniendo mutantes de otros inhibidores previamente informados, con el objetivo de anular algunas actividades inhibidoras y potenciar otras, de manera de convertir algunas de estas moléculas en antimaláricos potenciales Esta estrategia también se está utilizando frente a otras dianas terapéuticas de relevancia en enfermedades infecciosas (Leishmaniasis y Chagas, Silva-Lopez et al 2007) y sistémicas como cardiovasculares y respiratorias, entre otras (González et al 2004; García-Fernández et al, 2009).

Coordinadora general del grupo:

PhD Maday Alonso del Rivero Antigua Investigador Titular (maday@fbio.uh.cu)

Asesora

PhD María de los Ángeles Chávez Planes, Prof. Titular y Académico Titular (mchavez@fbio.uh.cu)

Líneas de investigación

Línea: Proteasas de tipo serino e inhibidores con aplicaciones potenciales en la Biomedicina y Biotecnología (maday@fbio.uh.cu; mchavez@fbio.uh.cu)

Esta línea se centra en la caracterización estructural y funcional de proteasas serino y sus inhibidores, principalmente aislados de organismos marinos, estudios de la relación estructura-función de las proteasas serino con sus inhibidores, así como su evaluación funcional en diferentes modelos in vitro, de acuerdo a sus potencialidades para la Biomedicina y/o Biotecnología.

PhD Rossana García-Fernández, Investigador Agregado (rossana@fbio.uh.cu). Su investigación se basa en los  estudios de relación estructura-función del inhibidor mayoritario presente en la anémona marina Stichodactyla helianthus. Especialización en estudios de cristalización y difracción de rayos X de complejos proteasa-inhibidor.

MSc Aymara Cabrera Muñoz, Profesor instructor (aymara@fbio.uh.cu). Colaborador del CEP, estudiante de doctorado. Realiza su investigación en la determinación de la estructura tridimensional de CmPI II, un inhibidor de serino proteasas mediante RMN.   Participa en estudios de relación estructura función de este inhibidor frente a subtilisina y elastasa de neutrófilos humano.

Lic Laritza Rojas Perez, aspirante a investigado (laritza@fbio.uh.cu). Estudiante de maestría, realiza su tesis en la evaluación del efecto de inhibidores de serino proteasas sobre el crecimiento del cultivo del parásito Plasmodium falciparum.

MSc Maikel Izquierdo Rivero, especialista (mizquierdo@fbio.uh.cu) realiza su trabajo de investigación en la evaluación del efecto de inhibidores de proteasas sobre el crecimiento de larvas de Spodoptera fugiperda, lepidóptero que acata al cultivo del maíz.

Lic Jessica Beatriz González Alonso: adiestrada (jgonzalez@fbio.uh.cu). Realiza su entrenamiento en la obtención de mutantes de CmPI II mediante bibliotecas de fagos.

Línea: Caracterización molecular y funcional de metalocarboxipeptidasas y sus inhibidores aislados a partir de invertebrados marinos. Estudios de estructura-función. Aplicaciones biomédicas y biotecnológicas

PhD. Maday Alonso del Rivero, Investigador titular  (maday@fbio.uh.cu). dirige la línea de metalocarboxipeptidasas y sus inhibidores con aplicaciones biomédicas y biotecnológicas, relacionadas fundamentalmente con enfermedades parasitarias y cáncer. El grupo tiene experiencia en la purificación, caracterización estructural de proteínas, clonaje y expresión de proteínas en el sistema de Pichia pastoris, técnicas de mutagénesis dirigida para estudios de relación estructura-función de proteasas e inhibidores, así como caracterización cinetica de proteasas e inhibidores tanto naturales, como recombinantes. Se destaca su experiencia en la identificación de inhibidores mediante técnicas proteómicas, basadas en la atenuación de la intensidad de la señal de espectrometría de masas.

PhD. Mey Ling Reytor González, Asistente (mey@fbio.uh.cu): desarrolló su tesis doctoral en la dilucidación del mecanismo de interacción de SmCI con la carboxipeptidasa A mediante la obtención recombinante de sus dominios individuales, así como la obtención de la estructura cristalográfica del complejo SmCI/Carboxipeptidasa A4 humana. Actualmente estudia la interacción de este inhibidor con serino proteasas

Lic. Liliana Mirabal Ortega (lily@fbio.uh.cu) recién graduada: estudiante de maestría, su proyecto está relacionada con la obtención y carácterización del primer dominio recombinante de SmCI.

Línea: Caracterización molecular y funcional de aminopeptidasas de tipo serino y metalo y sus inhibidores aislados a partir de invertebrados marinos. Aplicaciones biomédicas y biotecnológicas.

PhD Isel Pascual Alonso, Profesor titular (isel@fbio.uh.cu): dirige la línea de aminopeptidasas de tipo serino y metalo y sus inhibidores con aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. Esta línea está relacionada principalmente con las aminopeptidasas de tipo metalo de la familia M1 piroglutamil aminopeptidasa II (PPII) y aminopeptidasa N (APN), así como la aminopeptidasa de tipo serino dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV). Estas enzimas se encuentran involucradas en patologías humanas como la inflamación, el cáncer, la diabetes mellitus tipo 2, desórdenes del sistema nervioso central y en enfermedades parasitarias. Recientemente, se ha iniciado en el grupo el trabajo de clonaje, expresión en Escherichia coli, purificación, caracterización y búsqueda de inhibidores para la PfAM1 miembro de la familia M1 presente en parásitos como el Plasmodium falciparum, agente causal de la malaria. En paralelo se trabaja con la enzima PePN contraparte de E coli, como modelo en la búsqueda de antiparasitarios. El grupo tiene experiencia en la purificación, caracterización estructural de proteínas, clonaje y expresión de proteínas en el sistema de E coli, así como caracterización cinética de proteasas e inhibidores tanto naturales como sintéticos.

MSc Jorge González Bacerio, Profesor Auxiliar  (jogoba@fbio.uh.cu): desarrolla su tesis doctoral en el tema de clonaje, expresión en E.coli y caracterización de PfAM1,  y la búsqueda de antimaláricos a partir  peptidomiméticos basados en bestatina. 

Lic. Lisset Diaz Guevara: Adiestrada (lisset@fbio.uh.cu): desarrolla su proyecto de tesis de Maestría en Bioquímica en el campo de nuevos inhibidores de la enzima DPPIV humana con potenciales aplicaciones biomédicas en cáncer. Las nuevas moléculas identificadas mediante herramientas bioinformáticas, han sido validadas experimentalmente en modelos cinéticos y modelos celulares de diferentes tipos de cáncer con resultados altamente promisorios. Estas moléculas se caracterizan por una elevada especificad frente a DPPIV en relación con otros miembros de la familia.

MSc. Yarini Arrebola : Especialista (yarinim@infomed.sld.cu):  Colaborador del CEP, desarrolla su proyecto de tesis de Doctorado en Ciencias Biológicas en el campo de nuevos inhibidores de la enzima APN humana con potenciales aplicaciones biomédicas en cáncer. Las nuevas moléculas identificadas mediante herramientas bioinformáticas, han sido validadas experimentalmente en modelos cinéticos y modelos celulares de diferentes tipos de cáncer con resultados altamente promisorios. Estas moléculas se caracterizan por una elevada especificad frente a APN en relación con otros miembros de la familia M1 de las metaloaminopeptidasas.

MSc. Laura Sánchez: profesor (laura@fbio.uh.cu): Colaborador del CEP, desarrolla su proyecto de investigación en el campo del tamizaje e identificación de actividad inhibidora de la APN humana a partir de fuentes naturales de la biodiversidad de la fauna terrestre y de invertebrados marinos cubanos.

 

Línea: Diseño racional de derivados inmovilizados

MSc Alberto del Monte Martinez. Investigador auxiliar (adelmonte@fbio.uh.cu)  Dirige esta línea de investigación. Existe una experiencia de trabajo de 20 años en la síntesis de derivados inmovilizados para su utilización en cromatografía de afinidad, bioconversión enzimática, biosensores, biorreactores enzimáticos, aplicaciones analíticas, enzimas inmovilizadas como agentes terapéuticos, etc., con aplicaciones en las industrias Biotecnológica, Nanotecnológica, Químico-Farmacéutica, Agroquímica y Alimentaria. En la actualidad desarrollan una Estrategia de Diseño Racional de Derivados Inmovilizados (RDID), en la cual se combinan algoritmos matemáticos y herramientas bioinformáticas. Esta estrategia ha sido implementada en el programa RDID1.0 lo que permite seleccionar la vía más adecuada para sintetizar derivados inmovilizados óptimos.