Grupo de TOXINAS Y LIPOSOMAS

Toxinas Formadoras de Poro con potenciales aplicaciones en la Biomedicina y la Nanobiotecnología

Un tema de investigación de gran impacto por su novedad lo constituye el estudio de dos toxinas formadoras de poros, purificadas a partir de la anémona marina Stichodactyla helianthus denominadas: sticholysinas I y II (StI/II, Sts) (Lanio et al, 2001:187). Estas proteínas de aproximadamente 20 kDa y punto isoeléctrico superior a 9.5, carecen de cisteína y muestran una preferencia por las membranas que contienen esfingomielina. Uno de los rasgos más interesantes de estas proteínas es que siendo moléculas hidrosolubles, poseen la capacidad de incorporarse a membranas naturales y modelos formando poros de un tamaño definido (Martínez et al, 2001:1547; Tejuca et al, 2001:125). A pesar de que existen más de 1000 especies de anémonas identificadas, hasta el momento solo 31 actinoporinas han sido informadas y de ellas aproximadamente 20 tienen secuencias aminoacídicas conocidas (Alvarez et al., 2009; Anderluh y Maček, 2002) y 4 estructura tridimensional resuelta (Athanasiadiset al., 2001; García-Linares et al., 2013; Mancheño et al., 2003; Mechaly et al., 2011).  La elevada similitud entre las estructuras solubles de las actinoporinas en solución permite identificar las siguientes características comunes: un núcleo central de hojas-β intercalado, dos hélices-α que flanquean la estructura en sándwich-β y un sitio de unión interfacial (SUI) mediante el cual interaccionan con las membranas. La actividad permeabilizante de las Sts tiene una fuerte dependencia de la composición lipídica de la membrana, favorecida por la presencia de SM y lípidos no formadores de bicapas (Álvarez et al., 2001 y 2003; Martínez et al., 2007).  En general el mecanismo más aceptado para explicar la formación del poro involucra un paso inicial de unión de la proteína a la membrana seguido de la inserción del terminal amino y la consecuente oligomerizacion en la membrana, conducente a la formación del poro (Hong et al., 2002, Rokjo et al, 2013).  El segmento del extremo amino (aproximadamente los primeros 30 aminoácidos) que contiene una de las hélices-α debe separarse del plegamiento central de hojas-β intercaladas para formar las paredes del poro (Mancheño et al., 2003). 

Estas proteínas al formar poros en las membranas pueden provocar la muerte celular lo cual ha motivado la búsqueda de posibles aplicaciones biomédicas tales como construcción de inmunotoxinas (ITs) dirigidas contra células indeseadas, como las parasitarias (Tejuca et al, 1999: 489) o las cancerosas (Tejuca et al, 2004:731, Tejuca et al, 2009:15). Las ITs son proteínas quiméricas constituidas por una toxina y un componente direccionalizador hacia un tipo de célula que se desea eliminar. Las toxinas más utilizadas en la construcción de las ITs van dirigidas contra blancos intracelulares provocando, por ejemplo, la inhibición de la síntesis proteica de la célula diana. Sin embargo, la citotoxicidad de los inmunoconjugados construidos a partir de esta clase de toxina depende de su internalización hacia el citosol y de la evasión de la maquinaria degradativa lisosomal. En este sentido, las ITs que utilizan como componente tóxico las citolisinas de anémonas de mar (actinoporinas), constituyen una alternativa con ventajas potenciales, pues su modo de acción estaría dirigid directamente a la membrana celular. Sin embargo, la actividad inespecífica asociada a la toxina ha sido un factor común en todas las construcciones obtenidas hasta el momento con actinoporinas. Una posibilidad de superar esta limitación es la construcción de ITs inactivas con un mecanismo de activación que responda a un estímulo biológico. En particular, las citolisinas pueden activarse por la acción de proteinasas asociadas a tumores. En esta dirección se trabaja en el diseño de ITs basadas en actinoporinas activables por metaloproteasas de matriz, así como las perspectivas de su uso como parte de cocktails quimioterapéuticos. Trabajando sobre estas ideas básicas, se encuentran en desarrollo en el CEP diversas aproximaciones para el empleo de estas toxinas o de péptidos que mimetizan zonas funcionalmente relevantes de las Sts (Casallanovo et al, 2006:169; Cilli et al, 2007:1201). Las proteínas formadoras de poro también muestran propiedades interesantes para el diseño de novedosos sistemas de entrega de moléculas al citosol celular de manera análoga a como han sido empleadas otras toxinas de origen bacteriano (Dietrich, 2001:23), un problema científico directamente asociado al desarrollo de vacunas contra el cáncer, entre otras enfermedades. Basados en Sts encapsuladas en liposomas, un nuevo sistema de liberación de antígenos al citosol de las células presentadoras de antígenos como plataforma vacunal ha sido desarrollado por el CEP (Lanio et al. 2014).

Estos proyectos dirigidos al empleo potencial de estas toxinas en la nanobiotecnología se han desarrollado contando con la alianza, en primer lugar, del Centro de Inmunología Molecular (CIM) y la contribución de otras instituciones cubanas como es el Centro Nacional de Investigaciones Científicas. En su conjunto, estas investigaciones son una muestra de cómo el conocimiento básico acumulado en la comprensión de las relaciones entre la estructura y la actividad biológica de tan singulares moléculas (Tejuca et al, 1996: 14947), de su modificación por mutagénesis dirigida (Pazos et al, 2003: 571 ; Pazos et al, 2006:1083), y en general el arsenal de conocimientos acumulados en más de veinte años de trabajo con estas toxinas, resumido recientemente (Alvarez et al, 2009, Tejuca et al, 2009), ha contribuido al desarrollo de sus potenciales aplicaciones en la Biomedicina. En ello también se ha contado con las colaboración de entidades internacionales tales como la Universidad de Santiago de Chile, Universidad Federal de São Paulo y Universidad de São Paulo, Universidad de Córdoba, entre otras

La bionanotecnología se anuncia como una de las grandes promesas del futuro en diferentes esferas de la vida y la sociedad, una de ellas, asociada al desarrollo de nuevas formulaciones terapéuticas que puedan ser direccionalizadas a determinados destinos celulares, es decir, lograr construir medicamentos inteligentes lo cual redundaría en un incremento de su efectividad y una disminución de la toxicidad. Una de las líneas de investigación más importantes del Centro es la preparación y caracterización de vesículas liposomales con diferentes propósitos. Los liposomas (LP) son vesículas preparadas artificialmente de talla nanométrica -aunque algunas pueden alcanzar tamaños mayores- de forma aproximadamente esférica con una fase acuosa interna rodeada por una o más bicapas lipídicas. La racionalidad que existe en el empleo de los LP en inmunizaciones y en el diseño de vacunas se basa en su capacidad para liberar la molécula antigénica en células específicas del sistema inmunológico y estimular una respuesta inmune. El empleo de liposomas como inmunoadyuvantes tuvo unos de sus primeros resultados en nuestro país, con la obtención de anticuerpos anti-gangliósidos a través de la inmovilización de los antígenos glicolopídicos en vesículas liposomales en colaboración con el CIM (Vázquez et al, 1995:551). El Centro ha incursionado también en el empleo de liposomas como adyuvantes para modular antígenos como el EGF (Luzardo et al, 2002: 147; Lanio et al, 2008:1) y los antígenos del ácaro Dermatophagoides siboney(Calderón et al, 2006:38), cuyos resultados muestran la eficacia de estos sistemas. Recientemente, ha aparecido publicada una actualización de los resultados y perspectivas del CEP en el empleo de LP como instrumentos nanobiotecnológicos (Lanio et al, 2009:23) y la construcción de inmunotoxinas (Tejuca et al, 2009:15).

Coordinadora general del grupo

PhD. María Eliana Lanio Ruiz, Profesor Titular (mlanio@fbio.uh.cu)

Líneas de investigación

Línea: Toxinas formadoras de poro y péptidos que las mimetizan

PhD. Carlos Alvarez Varcárcel, Profesor Titular (calvarez@fbio.uh.cu): dirige la línea de Toxinas formadoras de poro y péptidos que las mimetizan. Esta línea se centra en profundizar en los mecanismos moleculares de cómo y por qué se unen las sticholysinas a las membranas, los requerimientos lipídicos y propiedades físico-químicas de las membranas lipídicas para su acción, las consecuencias para las células de la interacción de estas proteínas con las membranas y el empleo de péptidos sintéticos que reproducen el N-terminal de estas toxinas para mimetizar su actividad y rasgos conformacionales.

MSc. Lohans Pedrera Puentes, instructor (lohans@fbio.uh.cu). Realiza su Tesis de Doctorado en el estudio de los componentes lipídicos de la membrana celular como moduladores en la unión y la actividad permeabilizante de las sticholysinas.

MSc. Carmen Soto Febles, Profesor Auxiliar (carmensoto@fbio.uh.cu). Es colaboradora del CEP donde realiza su Tesis de Doctorado en el estudio de los determinantes de la membrana celular que modulan la unión y la actividad permeabilizante de las sticholysinas y los mecanismos desencadenados intracelularmente por la acción de estas toxinas

 

Línea: Mutantes de cisteina como herramienta para estudios estructurales y funcionales de Sticholysinas

PhD. Isabel Fabiola Pazos Santos, Profesor Titular (). Dirige la línea de Mutantes de cisteína como herramienta para estudios estructurales y funcionales de sticholysinas. Esta línea se enmarca en la clonación, expresión y caracterización estructural y funcional de variantes recombinantes de sticholysinas, así como en el diseño de mutantes de cisteína que permitan profundizar en el mecanismo de formación de poros de estas toxinas.

PhD Aisel Valle Garay, Profesor Auxiliar (aiselvalle@fbio.uh.cu).  Es colaborador del CEP e investiga en la línea relacionada con mutantes de cisteína de Sticholisina I para dilucidar nuevos aspectos moleculares en el mecanismo de formación de poros de las actinoporinas.

MsC Yadira de la Patria Hervis Valdés Instructor. (patria@fbio.uh.cu). Realiza su tesis de doctorado en el estudio del mecanismo de formación de poros de sticholysinas mediante el empleo de la espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica.

Lic Luis Benito Pérez Socas (lsocas@fbio.uh.cu). Adiestrado y colaborador del CEP. Realiza su trabajo de adiestramiento en la obtención de sticholysinas de su fuente natural, recombinante y mutantes de cisterna.

Lic. Liem Canet Santos (lcanet@fbio.uh.cu). Especialista. Se encuentra vinculada en la obtención y caracterización estructural y funcional de sticholysinas recombinante y mutantes de cisteína.

Línea: Liposomas y Sticholysinas: sus aplicaciones en la nanobiotecnología

PhD. María Eliana Lanio Ruiz, Profesor Titular (mlanio@fbio.uh.cu). Dirige la línea relacionada con las aplicaciones nanobiotecnológicas de las sticholysinas en la que se encuentran el diseño de inmunotoxinas dirigidas contra células tumorales y de sistemas de liberación de macromoléculas al citosol celular basados en liposomas y sticholysinas

PhD. María del Carmen Luzardo, Profesor titular (mcluzardo@fbio.uh.cu), Colaboradora del CEP Dirige el tema del empleo de liposomas como adyuvantes para el modelo de alergénos

PhD. Yoelys Cruz Leal, Investigador Auxiliar (yoelys@fbio.uh.cu). Desarrolló su Tesis de doctorado en la temática de los posibles roles de las células B1 en la capacidad inmunoadyuvante de los liposomas. Actualmente dirige líneas dentro del tema de sistemas de liberación de macromoléculas al citosol celular basados en liposomas y sticholysinas

MsC. Rady Laborde Quintana, asistente (radylq@fbio.uh.cu). Su Tesis de doctorado se enmarca en el diseño de nuevos sistemas liberación de antígenos al citosol celular basados en liposomas y sticholysinas como plataforma vacunal terapéutica contra células tumorales.

Lic Felipe Escalona Rodriguez, Aspirante a investigador (felipe@fbio.uh.cu). Desarrolla su tesis de Maestría en el tema de sistemas de liberación de macromoléculas al citosol celular basados en liposomas y sticholysinas

Lic Anaixis del Valle, recién graduada (ana@fbio.uh.cu). Desarrolla su tesis de Maestría en el tema de sistemas de liberación de antígenos al citosol celular basados en liposomas y sticholysinas como plataforma vacunal contra células tumorales

Lic Mickel Palomino Arias, especialista (mparias@fbio.uh.cu). Desarrolla su tesis de Maestría en el proyecto de  inmunotoxinas

 

Línea: Inmunoanalítica y péptidos antimicrobianos

 

Dr. Anselmo J. Otero González, Investigador Titular (aotero@fbio.uh.cu) Dirige el laboratorio de Inmunoanalítica y Péptidos Antimicrobianos. Presidente del tribunal nacional permanente para el otorgamiento de grados científicos en Biología Celular y Molecular.  Aislamiento y caracterización de péptidos antimicrobianos de invertebrados marinos y terrestres.