CONFERENCIA

TRANSCRIPCIÓN DEL DNA Y
MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES


(continuación, pág. 4)

Sumario

Concepto de transcripción y características básicas
Transcripción en procariontes
Transcripción en eucariontes
Moficaciones postranscripcionales
Modificaciones del hnRNA
Maduración del rRNA eucariota
Los intrones de Grupo I y II
El splicing del tRNA de las levaduras
El splicing diferencial


Transcripción los genes de Clase II

La RNA polimerasa II tiene ~10 subunidades con una masa de ~500 kDa. La Polimerasa II no puede iniciar la transcripción por sí sola y depende completamente de factores auxiliares de la transcripción. La enzima, conjuntamente con estos factores constituye el aparato básico de transcripción necesario para transcribir cualquier promotor.

La subunidad mayor de la RNAPII posee una estructura única que no se encuentra en ninguna otra polimerasa; se trata de un dominio poco común en el extremo carboxílico de la subunidad mayor. Esta estructura se llama CTD (carboxy terminal domain) y está constituida por repeticiones en tándem (52 veces en el ratón) de la secuencia consenso heptapeptídica tyr-ser-pro-treo-ser-pro-ser. La estructura es fosforilable pero no se conoce porqué ni su función. Existen evidencias que indican que cada vuelta de transcripción está asociada con la fosforilación reversible de CTD. No obstante, se ha diseñado un modelo general en el cual las interacciones de la RNAPII con el promotor están mediadas, al menos en parte, por la interacción de CTD con los componentes del complejo de preiniciación. La estructura CTD es indispensable para la viabilidad celular.

El primer punto para considerar la organización del promotor es definir un promotor "genérico" que será la secuencia más corta en la cual la RNA polimerasa II puede iniciar la transcripción y caracterizar las subunidades de la enzima y los factores de transcripción que se necesitan para reconocerlo. Un promotor genérico puede, en principio, expresarse en cualquier célula: no depende de secuencias cuyo uso esté bajo control específico del tejido. Las proteínas accesorias que requiere la polimerasa II para iniciar en este promotor definen los factores generales de transcripción implicados en la mecánica de unión al DNA y la iniciación de la transcripción.

El número de factores que pueden actuar conjuntamente con la RNA polimerasa II es muy grande. Se han dividido en tres grupos generales:

» Los factores generales se requieren para la mecánica de iniciar la síntesis del RNA en todos los promotores. Ellos se unen con la RNA polimerasa para formar un complejo que rodea el punto de inicio, y determinan el sitio de iniciación. Los factores generales, conjuntamente con la RNA polimerasa, constituyen el aparato básico de transcripción.

» Los factores anteriores (upstream) son proteínas de unión al DNA que reconocen elementos consenso cortos y específicos que se encuentran antes del punto de inicio. La actividad de estos factores no se regula; ellos son omnipresentes, es decir, siempre están presentes en todas las células. También actúan sobre cualquier promotor que contenga los sitios adecuados de unión al DNA. Ellos aumentan la eficiencia de la iniciación, y se necesitan para que un promotor funcione a un nivel adecuado. El grupo exacto de factores necesario para la total expresión del gen es característico de cualquier promotor específico.

» Los factores inducibles funcionan de la misma manera general que los factores anteriores, pero tienen un papel regulador. Se sintetizan o activan en momentos específicos o en tejidos específicos, y son por tanto, responsables del control de patrones de transcripción en tiempo y espacio. Las secuencias a las cuales se unen se llaman elementos respuesta.

Los factores generales se describen como TFIIX, donde la X es una letra que identifica el factor individual. Un promotor genérico funciona sólo a muy baja eficiencia; se necesitan factores anteriores adicionales para alcanzar un nivel adecuado de función. Los factores anteriores y los inducibles no se describen sistemáticamente, sino que tienen nombres casuales que reflejan sus historias de identificación.

Se puede esperar que las secuencias involucradas en la unión de la RNA polimerasa y de los factores generales de transcripción estén conservadas en la mayoría de o en todos los promotores. Al igual que en el caso de los promotores bacterianos, cuando se comparan los promotores de la RNA polimerasa II, las homologías en las regiones cercanas al punto de inicio están restringidas a secuencias bastante cortas. Estos elementos se corresponden con las secuencias comprometidas en la función del promotor debida a mutaciones.

En el punto de inicio no hay una gran homología de secuencias, pero sí hay una tendencia a que la primera base del mRNA sea una A flanqueada a cada lado por pirimidinas. (Esta descripción es también válida para la secuencia de inicio CAT en los promotores bacterianos). Esta región se llama el iniciador (Inr), y se puede describir en la forma general Py2CAPy5. El Inr está entre las posiciones -3 y +5. Un promotor que sólo tiene el Inr tiene la manera más sencilla posible de ser reconocido por la RNA polimerasa II.

La mayoría de los promotores tiene una secuencia llamada la caja TATA, localizada generalmente ~25 pb antes del punto de inicio. Constituye el único elemento del promotor antes del punto de inicio que posee una localización relativamente fija respecto al punto de iniciación de la transcripción. La secuencia consenso de 8 pb consiste enteramente de pares de bases A•T (en dos posiciones la orientación es variable), y sólo en una minoría de los casos conocidos es un par G•C. La caja TATA tiende a estar rodeada de secuencias ricas en G•C, que pudiera ser un factor que influya en su función. Es casi idéntica a la secuencia -10 de los promotores bacterianos. De hecho, pudiera pasar por uno excepto por la diferencia en su localización en -25 en lugar de en -10.

Las sustituciones de una sola base en la caja TATA actúan como fuertes mutaciones bajas. Algunas mutaciones invierten la orientación de un par A•T, de manera que la composición de bases solamente no es suficiente para su funcionamiento. Por tanto, la caja TATA es un elementos cuyo comportamiento es análogo a nuestro concepto de un promotor bacteriano: una secuencia corta, bien definida, colocada justo antes del punto de inicio, que es necesaria para la transcripción. La minoría de los promotores que no contiene el elemento TATA se llama promotores carentes de caja TATA.


Mecanismo de ensamblaje del complejo de iniciación de la RNA Polimerasa II

El primer paso en la formación del complejo de preiniciación en un promotor que contenga una caja TATA es la unión del factor TFIID a una región que se extiende en la dirección 5' (upstream) de la secuencia TATA. TFIID contiene dos tipos de componente: la proteína de unión a TATA (TBP) (TATA-binding protein) que es una pequeña proteína de ~30 kDa y ~11 TAFs (TBP-associated factors), factores asociados a TBP con una masa total típica de ~800 kDa. TFIID es el único responsable del reconocimiento de un promotor por la RNA polimerasa II.

TBP es el primer factor que hace contacto con un promotor de clase II y a veces se considera como un "factor de compromiso" que en efecto consigna que un promotor se transcriba. Debido a que la caja TATA está situada a una distancia fija del sitio de inicio, su reconocimiento es importante para "poner en posición" a la RNA polimerasa. El factor TBP se necesita para iniciar la transcripción por parte de cualquiera de las tres RNA polimerasas eucariotas (Fig. 20.08, Genes VII). En cada caso, TBP constituye una subunidad de algún factor de transcripción que se une al DNA en la vecindad del sitio de inicio. TBP se une directamente a la Caja TATA cuando ésta está presente, y en los promotores carentes de Caja TATA se ubica cerca del sitio de inicio por otros medios.

La iniciación requiere que los factores de transcripción actúen en un orden definido pero no exclusivo para construir un complejo al cual se una la RNA polimerasa. Se puede conocer la serie de eventos que tiene lugar por el aumento del tamaño del complejo proteico asociado al DNA. A medida que cada factor TFII se une al complejo, se cubre un tramo más del DNA. La RNA polimerasa se incorpora en una etapa más tardía. El resto de los factores de transcripción involucrados en el complejo de iniciación tiene cada uno su rol determinado. Después de la unión de TFIID, los factores generales de transcripción de la RNAPII se encargan de ensamblar el aparato básico de transcripción en el promotor y casi todos se liberarán cuando la RNAPII comience la elongación.

El proceso general de la iniciación es similar al catalizado por la RNA polimerasa bacteriana. La unión de la RNA polimerasa genera un complejo cerrado que se convierte posteriormente en complejo abierto cuando las cadenas de DNA se han separado. En la reacción bacteriana, la formación del complejo abierto completa el cambio estructural necesario del DNA. Una diferencia en la reacción eucariota es que se necesita más desenrollamiento del molde después de esta etapa.

¿Qué sucede en los promotores carentes de caja TATA? En este caso se necesitan los mismos factores generales de transcripción, incluyendo TFIID. El Inr ofrece los elementos de posición; TFIID se une a él gracias a la posibilidad que tienen uno o más TAFs de reconocer directamente el Inr. La función de TBP en estos promotores es más parecida a la que tiene en los promotores de la RNA polimerasa I y en promotores internos de la RNA polimerasa III.

El ensamblaje del complejo de iniciación de la RNA polimerasa II ofrece un contraste interesante con la transcripción procariota. La RNA polimerasa bacteriana es esencialmente un agregado coherente con una habilidad intrínseca de unirse al DNA. El factor sigma, necesario para la iniciación pero no para la elongación, se convierte en parte de la enzima antes de que se una al DNA, aunque más tarde se libera. Pero la RNA polimerasa II puede unirse al promotor solamente después de que factores de transcripción independientes se han unido. Los factores son fundamentalmente responsables de la especificidad en el reconocimiento del promotor. Solamente algunos factores participan en los contactos proteína-DNA (y sólo TBP hace contactos específicos de secuencia). Por tanto, las interacciones proteína-proteína son importantes en el ensamblaje del complejo.

Los promotores de la RNA polimerasa II tienen elementos de secuencias cortas

El promotor de la RNA polimerasa II tiene dos tipos de región. El propio sitio de iniciación se identifica por el Inr y/o la caja TATA cercana. Conjuntamente con los factores generales de transcripción, la RNA polimerasa II forma un complejo de iniciación que rodea el punto de inicio, tal y como se ha descrito. La eficiencia y la especificidad con las cuales se reconoce el promotor dependen, sin embargo, de secuencias cortas, situadas mucho más en dirección 5' (upstream), que son reconocidas por factores anteriores o factores inducibles. Estas secuencias y los factores que las reconocen pueden ser comunes, y encontrarse en una amplia variedad de promotores, o pueden ser específicas y muy particulares para realizar la transcripción en un tiempo o lugar restringido. Usualmente estas secuencias están ubicadas ~100 pb antes del punto de inicio, pero a veces están mucho más distantes. Los factores de unión a estos sitios pueden influir en la formación del complejo de iniciación en cualquiera de sus diversas etapas. La mayoría de las mutaciones en estas secuencias no afectan la habilidad del promotor para iniciar la transcripción.

Una de las secuencias anteriores es la caja CAAT. Nombrada por su secuencia consenso, fue uno de los primeros elementos comunes en describirse. Casi siempre está localizada cerca de -80, pero puede funcionar a distancias que varían considerablemente del punto de inicio. Funciona en ambas direcciones. Su susceptibilidad a las mutaciones sugiere que la caja CAAT juega un fuerte papel en la determinación de la eficiencia del promotor. No parece jugar un rol directo en la especificidad del promotor, pero su inclusión aumenta la fortaleza del promotor. La caja GC contiene la secuencia GGGCGG y también es variable en cuanto a su posición respecto al sitio de inicio. A menudo existen múltiples copias en el promotor, y ocurre en cualquier orientación. Es también un componente relativamente común del promotor.

Una gran variedad de elementos puede contribuir a la función del promotor, pero ninguno es esencial para todos los promotores. Los elementos anteriores son reconocidos por FT que interactúan con el complejo básico de transcripción con el fin de determinar la eficiencia con la cual se va a utilizar ese promotor. Los elementos encontrados en cualquier promotor difieren en número, localización y orientación. Ningún elemento es común a todos los promotores. Uno de los enigmas de la organización de los promotores es que el promotor comunica información direccional (la transcripción procede solamente en la dirección 3'), pero las cajas GC y CAAT pueden funcionar en cualquier orientación (aunque sus secuencias son asimétricas).

Se asume que los factores que están más o menos omnipresentes en todos los promotores están disponibles a cualquier promotor que tenga una copia del elemento que reconocen. Esta posibilidad común diferencia los factores anteriores de los inducibles. Los elementos en la categoría upstream incluyen la caja CAAT, la caja GC y el octámero. Todos los promotores probablemente necesiten uno o más de estos elementos para poder funcionar eficientemente.

El factor SP1 reconoce la caja GC. Esta interacción ilustra las demandas que pueden hacerse a un solo factor. La caja GC más cercana está generalmente a 40-70 pb antes del sitio de inicio, pero el contexto de las cajas GC es diferente en cada promotor. Así, en el promotor de la timidina quinasa, las cajas GC son adyacentes a la caja CAAT y a una caja TATA, pero en el promotor SV40, hay una serie de repeticiones en tándem de cajas GC antes de la caja TATA. La subunidad de SP1 es un monómero de 105 kDa, que hace contacto con una cadena del DNA en un sitio de unión de ~20 pb que incluye al menos una caja GC de 6 pb. En el promotor SV40, las múltiples cajas entre -70 y -110 están todas unidas, de manera que toda la región está cubierta por SP1. Sin embargo, en el promotor de la timidina quinasa, SP1 presuntamente interactúa con un factor unido a la caja CAAT por un lado, y con TFIID unido a la caja TATA por el otro. Las secuencias a las cuales se unen los factores son generalmente más largas que las secuencias consenso identificadas al comparar promotores. La siguiente tabla resume las propiedades de los factores más comunes:

Módulo Consenso
Unido al DNA
Factor
Caja TATA TATAAAA
~10 pb
TBP
Caja CAAT GGCCAATCT
~22 pb
CTF/NF1
Caja GC GGGCGG
~20 pb
SP1
Octámero ATTTGCAT
~20 pb
Oct-1
Octámero ATTTGCAT
~23 pb
Oct-2
κB GGGACTTTCC
~10 pb
NFκB
ATF GTGACGT
~20 pb
ATF

Generalmente cubren ~20 pb del DNA, mientras que las secuencias consenso tienen < 10 pb. Dadas las tallas de los factores, y la longitud del DNA que ellos cubren, se espera que las diversas proteínas cubrirán juntas toda la región anterior al sitio de inicio en la cual residen los elementos. La diversidad de elementos a partir de los cuales se pueden construir los promotores y la variación en su localización relativa al sitio de inicio indican que los factores tienen la posibilidad de interactuar entre ellos mediante interacciones proteína-proteína en múltiples formas. Parece no haber restricciones en las relaciones potenciales entre los elementos.

Hasta aquí se ha considerado al promotor como una región aislada responsable de la unión de la RNA polimerasa. Pero los promotores eucariotas no necesariamente funcionan por sí solos. En al menos algunos casos, la actividad de un promotor aumenta enormemente por la presencia de un enhancer, que consiste en otro grupo de elementos pero localizado a una distancia variable de los que hasta ahora hemos contemplado como que forman parte del propio promotor. Los enhancers y los factores inducibles se estudiarán con detalle en la regulación de la expresión génica en eucariontes.

Terminación de la transcripción en eucariontes

La unidad de transcripción eucariota generalmente contiene un solo gen, y la terminación tiene lugar más allá del final de la región codificadora. Quisiéramos definir el mecanismo de terminación, pero le falta la importancia reguladora que se aplica a los sistemas procariotas. Las RNA polimerasas I y III terminan en secuencias discretas en reacciones definidas, pero el modo de terminación por la RNA polimerasa II no se ha aclarado aún. Sin embargo, el evento significativo de generar el extremo 3' de un mRNA no es un evento de terminación como tal, sino que es el resultado de una reacción de corte en el transcrito primario.

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