CONFERENCIA

REPLICACIÓN DEL DNA

(continuación, página 5)

Sumario

Características generales de la replicación
Mecanismos de replicación del DNA de E. coli
Control de la replicación y ciclo celular en procariontes
Replicación del DNA eucariotico
Control de la replicación y ciclo celular en eucariontes
Otras estrategias replicativas

En un tiempo se pensó que la DNA pol α sintetizaba la hebra seguidora, mientras que la DNA pol δ, la conductora.  Ahora parece que el papel de la primera es iniciar y la segunda elongar ambas cadenas.  De esta forma la misma secuencia básica de eventos ocurre durante la iniciación de ambas la cadena guía y los fragmentos de Okazaki de la seguidora.  Aunque no se sabe con certeza si el mismo complejo Pol α /primasa que inicia la cadena guía se usa para la seguidora, pero se puede especular con el siguiente modelo:

La horquilla de replicación contiene 1 complejo de Pol a /primasa y 2 complejos Pol δ.  Estos dos últimos actúa de la misma forma que la pol III en el replisoma de E. coli.  La procesatividad de Pol δ es mantenida por PCNA, cuya estructura cristalina se parece a la subunidad β de E. Coli y presenta tramos de aminoácidos conservados, a pesar de que están separadas por billones de años en la evolución.  No obstante son diferentes en secuencia y organización subunitaria (trímero). La Pol δ llena el espacio entre los fragmentos de Okazaki después que la exonucleasa MF1 ha eliminado el RNA.  La DNA ligasa I se requiere de forma específica para sellar las mellas entre los fragmentos de Okazaki una vez terminados.  La siguiente tabla muestra que se requieren funciones similares en las horquillas de replicación de E. coli y células de mamíferos:

Como ya fue mencionado los cromosomas eucarióticos son lineales y contienen extremos especializados llamados telómeros, que consisten de secuencias repetidas por Ej 5’-GGGTGGGTGGGT-3’. Estos extremos especializados en los cromosomas lineales son necesarios si consideramos que todas las polimerasas conocidas extienden las cadenas de DNA en la dirección 5’ 3’ y requieren un cebador.  La síntesis de la cadena guía se completa hasta el final del molde, pero debido a que el molde de la seguidora se copia de forma discontinua no puede ser replicado en su totalidad.  Sin algunos mecanismos especiales, las cromátidas hijas resultantes de la síntesis de la cadena conductora se acortarían con cada ciclo de la división celular.  La enzima que evita este acortamiento progresivo es una transcriptasa reversa modificada y se le llama telomerasa

Hay evidencias que soportan la hipótesis de que el acortamiento de los telómeros constituye un reloj que indica la vejez de las células. El telómero se va acortando cada vez más a medida que la célula se divide, debido a ésto la longitud del telómero se podría considerarse un reloj biológico para indicar cuántas divisiones celulares puede haber; pero en realidad no se ha visto una relación directa entre longevidad y longitud de telómeros. Si los telómeros se van acortando la célula muere, pero si se fueran alargando, la célula no viviría más tiempo, ejemplo: Mus spretus tiene telómeros de 15 Kb y Mus musculus tiene telómeros de 150 Kb, y por ello, el 2º no vive más que el 1º. Se cree que constituye un seguro contra el cáncer, ya que controla el número de divisiones celulares, y por tanto, la acumulación de mutaciones.

Una célula de la línea germinal tiene la telomerasa activa y, por tanto, la longitud del telómero permanece constante durante sucesivas divisiones celulares. En la célula somática disminuye la longitud de los telómeros y, cuando se llega a una longitud mínima, la célula entra en crisis y muere. Puede darse que alguna célula se "escape" a esa regulación: célula tumoral, el 90% de las células tumorales tienen una telomerasa activa, la longitud del telómero se mantiene constante o incluso se alarga, la longitud de ese telómero indicaría cuándo comenzó a desarrollarse ese tumor. ¿Se requiere la telomerasa para el desarrollo de tumores? si es así inhibidores de telomerasa se podrían emplear como agentes antitumorales. Pero no parece ser así, en un ratón knock-out en telomerasa se inducen tumores. Lo que si puede tener una utilidad práctica es como diagnóstico precoz, en algunos tumores como los de colon, vejiga y tiroides, donde la actividad telomerasa de unas pocas células se puede medir y relacionar con el grado de avance de la enfermedad. No se conocen los mecanismos que regulan la actividad telomerasa.  Esta actividad esta presente en muchos tejidos a través del desarrollo fetal.

Replicación de telómeros

Los telómeros son estructuras cuya función principal es dar estabilidad al cromosoma, de hecho los cromosomas partidos se degradan por los extremos sin telómeros. Se ha visto que los telómeros están formados por secuencias de longitud muy variable formadas por repeticiones de secuencias muy cortas ricas en G, sobre todo se han estudiado en protozoos ciliados, como Tetrahymena, Euplotes y Oxitrichia, ya que en su desarrollo los cromosomas se fragmentan adicionándose 40 000-100 000 telómeros, dependiendo de la especie.

ORGANISMO

SECUENCIA

LONGITUD kb

Tetrahymena

TTGGGG

0.4-0.6

Oxitrichia

TTTTGGGG

0.032

Euplotes

TTTTGGGG

0.18

Ratón

TTAGGG

100-150

Hombre

TTAGGG

2-20


Los telómeros tienen extremos protuberantes en 3’.
Al eliminarse el iniciador, el DNA se iría acortando en cada ronda de replicación, por lo que ha de haber un mecanismo que alargue los telómeros  en el que juega un papel central la telomerasa, un complejo ribonucleoprotéico (RNA + proteínas) que sintetiza DNA con un molde RNA. La telomerasa contiene un corto componente RNA de 159 bases (en Tetrahymena, 192 bases en Euplotes). Cada RNA incluye una secuencia de 15-22 bases que es idéntica a 2 repeticiones de una secuencia rica en repeticiones de C. Este RNA proporciona el molde para sintetizar repeticiones ricas en G. Las bases son añadidas individualmente en la secuencia correcta.  La enzima avanza discontinuamente: el molde de RNA se posiciona sobre el primer de DNA, varios nucleótidos se adicionan al primer y entonces la enzima se transloca (molde movible), para comenzar otra vez y así se van sintetizando las secuencias repetidas del telómero. Este mecanismo permite el alargamiento del extremo protuberante en 3’:

No se conoce como la cadena complementaria al telómero se ensambla, pero se puede especular que se sintetiza usando los extremos 3’OH de una horquilla terminal GT como cebador para la síntesis de DNA, así el telómero sintetizado a su vez sirve de molde para que la DNA polimerasa sintetice la complementaria dando lugar a DNA de banda doble. La siguiente figura  propone la existencia de un cuarteto de residuos de G, formados por una asociación de una G de cada unidad repetitiva:

En el ej. de la figura, la segunda G de cada  una de 4 unidades sucesivas de T2G4, forman un miembro del cuarteto.  El resto de las unidades repetidas forman lazos hacia fuera.  La asociación entre los residuos de G requiere que 2 de ellos cambien la orientación de la base con relación al azúcar (de la usual configuración anti a la no usual sin). La formación de esta estructura atestigua la propiedades no usuales de las secuencias ricas en G in vitro, pero no se ha demostrado que el cuarteto de G interaccione de esta forma in vivo.

Se han aislado RNAs de telomerasa (de humano, de ratón). La parte proteica, mucho más difícil de aislar, se ha conseguido en Euplotes, contiene regiones de homología con la transcriptasa inversa que, al igual que la telomerasa, sintetiza DNA con molde de RNA; además mutantes en esta región de la telomerasa pierden la actividad in vitro (in vivo el mutante tiene telómeros muy cortos). Se han encontrado genes homólogos en levadura y humanos, lo que sugiere que todas las telomerasas tienen actividad transcriptasa inversa.

Una caracteristica de los telómeros es su dinamismo: la telomerasa lo alarga y sucesivas rondas de replicación tienden a acortarlo. No se sabe cual es el mecanismo que regula la longitud del telómero; pero probablemente están implicadas proteínas de unión a telómeros. Se han aislado varias:

1)       En protozoos ciliados, la TBP (Telomere Binding Protein) se une a la banda simple del telómero.

2)       En mamíferos, TRF1 (Telomere Repeat Factor) .

3)       En levaduras, Rap1.

TRF1 y Rap1 se unen a DNA de doble banda, se cree que están implicadas en el mantenimiento de la longitud de los telómeros y su protección. La longitud de los telómeros permanece mas o menos constante en células con telomerasa. Pero la telomerasa no es siempre activa en todos los organismos eucariotas, y en este caso los telómeros se acortarán; la telomerasa es activa en:

·      Eucariotas unicelulares (levadura).

·      Células germinales de organismos superiores.

·      Algunas pocas células somáticas.

·      La mayor parte de células tumorales humanas.

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