CONFERENCIA

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN
GÉNICA EN PROCARIONTES

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Sumario

Introducción
Control de la iniciación de la transcripción
Un ejemplo clásico, el operón lac de E. coli
Mutaciones en el circuito regulador de lac
Sistemas reprimibles, el operón del triptófano
Control de la terminación de la transcripción


Mutaciones en el circuito regulador de lac

Resumiremos primero los componentes del sistema regulador que son esenciales para que la regulación pueda funcionar:

1. El represor se debe sintetizar correctamente y activo
2. El operador debe estar presente en el DNA y con la Secuencia correcta que se puede reconocer por el represor
3. El represor debe ser capaz de unirse al operador
4. El Inductor debe ser capaz de unirse al represor.

Cualquier fallo en uno de estos supuestos conducirá a un mutante que presentara distintos fenotipos respecto a la inducción del operon lac. Es importante aquí tener en cuenta que las mutaciones en trans producirán un producto difusible que está defectuoso. Ellos tienen la habilidad de complementar a un gen que se encuentre cercano. Por otra parte las mutaciones en cis son características de cualquier sitio que se encuentre físicamente contiguo con la secuencias que controla. Cuando dos sitios actúan en cis, se encuentran cerca, por ejemplo un promotor y un operador.

Mutaciones:

1. Mutante con un operador disfuncional. El operador está mutado (Oc). Pueden existir diferentes cambios en el operador, algunos pueden ser severos y tener grandes efectos. En estos casos el represor no se une al operador o su unión no es tan fuerte como en el tipo salvaje. La RNA polimerasa será capaz de expresar los genes del operon, por lo tanto se observara síntesis constitutiva de la β-galactosidasa. La cantidad de síntesis dependerá de la severidad de la mutación. Como estas mutaciones ocurren en el operador, se designan como Oc la c significa constitutivo (ver Fig. 10.7 Genes VII).

Consideremos lo que ocurre en un diploide parcial:

Si el inductor no está presente, entonces el represor se unirá normalmente al O+, pero sólo parcialmente a Oc. La β-galactosidasa se expresará desde el operon #1, pero no desde el operon #2. Si el inductor está presente entonces el represor no se unirá al operador y la β-galactosidasa se expresará desde ambos operones. Este mutante tiene un fenotipo lac+ constitutivo. Oc es dominante a O+, pero solamente en cis.

2. Mutante con un promotor disfuncional. En este caso el promotor no reconoce la RNA polimerasa y el operón no puede ser transcrito. Estas mutaciones actuarán en cis y el fenotipo será lac- constitutivo.

3. Mutaciones en el represor. El represor lac es codificado por el gen regulador i del operón, mutaciones en diferentes partes de este gen i se traducen en diferentes funciones afectadas del represor y por tanto en diferentes fenotipos resultantes. La figura 10.9 Genes VII evidencia como mutantes conocidos del represor ayudan a mapear las regiones del gen implicadas en una u otra función de la proteína:

Algunos mutantes del represor:

» Represor mutado con un sitio de unión al DNA disfuncional (I- ó lacId). En este caso el represor es incapaz de unirse al operador, por eso se observará expresión constitutiva de la β-galactosidasa. Si se construye un diploide parcial con el gen lacI+, el salvaje, se observará un fenotipo inducible. Por lo que se dice que lacI+, domina en trans sobre lacId. De aquí se deriva que la inducibilidad salvaje domina sobre la constitutividad mutante. Es interesante analizar que la dominancia en trans se origina porque el represor lac es un tetrámero y que las 4 subunidades deben estar completamente activas para unirse al operador. Cuando se transcriben y traducen ambos genes en un diploide parcial tendremos un pool de subunidades monoméricas, que se asociarán al azar, para dar un tetrámero funcional:

De los 5 posibles tetrámeros que se forman 4 son incapaces de unirse al DNA. Como los mutante I- son dominantes al salvaje los designan muchas veces como lacId, d = dominante.

» Represor mutado que no puede unirse al inductor (Is). En este caso si el inductor no puede unirse al represor, este se encontrará permanentemente enlazado al operador, ya que el represor tiene un afinidad muy alta por el operador KA = 1013 M-1. Estos mutantes se comportan como super-represores, se nombran como Is. Si se añade el inductor ellos no responderán. En un diploide parcial, aunque al añadir el inductor el represor tipo salvaje se disociará del operador, este sitio sería inmediatamente ocupado por un represor Is. Es decir el represor Is domina sobre el tipo salvaje. Por lo que se puede decir que la constitutividad mutante domina sobre la inducibilidad salvaje.


Sistemas reprimibles, el operón del triptófano

En la siguiente figura se resumen todos los casos posibles de inducción y represión:

El operón lac es un sistema inducible, al estar implicado en la degradación de un azúcar, sólo se induce en presencia de ese azúcar. El sentido biológico de esto es que los genes implicados en el metabolismo de azúcares están normalmente reprimidos y en presencia del inductor se induce la transcripción de su operón. Hay operones en los que el problema biológico es al contrario, como por ejemplo los operones de biosíntesis de aminoácidos, que sólo se expresan en ausencia del aminoácido. Cuando está el aminoácido en el medio, el operón está reprimido.

Este es el caso del operón del triptófano (que es un aminoácido esencial), cuando hay triptófano en el medio, la célula lo coge y no necesita sintetizarlo, por lo tanto el operón del triptófano está bloqueado cuando hay triptófano en el medio, cuando no hay triptófano en el medio, la célula ha de sintetizarlo, con lo que deja de estar reprimida la expresión de las enzimas implicadas en el metabolismo (síntesis) del triptófano. La estructura de este operón se representa a continuación:

El represor del triptófano reprime tres operones. Uno de ellos, trp, es el de los genes que codifican por las enzimas de síntesis del triptófano. Los otros dos son: el del gen del propio represor trpR y el de genes implicados en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos aroH. Cuando hay triptófano en el medio, éste se une con el represor interaccionando con el operador, por lo que no hay expresión de genes de síntesis de triptófano; cuando no hay triptófano presente en el medio el represor no puede unirse al operador y se expresan los genes del operón.

El represor se une a una secuencia repetida e invertida del operador, actúa por tanto como dímero; se conoce la estructura terciaria del represor del triptófano cada monómero interacciona con el DNA mediante un motivo HTH, en el dímero la distancia entre los dos motivos es de 34 Å (aproximadamente 1 vuelta de hélice) lo que indica que el dímero de represor se une al DNA por dos surcos mayores consecutivos. Es un fenómeno general para la mayor parte de los factores de transcripción procarióticos el tener estructuras terciarias con 2 hélices lectoras de surcos mayores consecutivos separadas a una distancia de 34 Å, que reconocen las secuencias del operador localizadas en surcos adyacentes.

En el caso del represor del triptófano, se une a DNA cuando está presente el aminoácido pero no en su ausencia; ésto es así por un cambio alostérico producido por la interacción del triptófano. El sitio de unión del triptófano con el represor está próximo a las cabezas lectoras de DNA (motivos HTH). Cuando el triptófano está unido al represor, las cabezas lectoras se encuentran a la distancia y orientación adecuada para interaccionar con surcos mayores consecutivos, cosa que no ocurre en ausencia de triptófano.


Control de la terminación de la transcripción

Así como la iniciación de la transcripción está sometida a control, la regulación de la transcripción también puede efectuarse a nivel de la terminación. Hay dos casos bien conocidos: atenuación y antiterminación.

Atenuación

La atenuación se da sobre todo en operones de biosíntesis de aminoácidos, por ejemplo, el operón del triptófano, que está formado por una serie de genes estructurales que codifican por enzimas implicados en la ruta de biosíntesis del triptófano. En el operón lac, la expresión de β-galactosidasa en el nivel inducido con respecto al basal era de 103 veces. En el operón del triptófano, cuando hay triptófano en el medio la expresión del operón se reprime 700 veces. ¿Cómo se explica esto si se tiene en cuenta que el represor solo reprime 70 veces? Ha de haber algún mecanismo adicional que multiplica por 10 los niveles de represión. La explicación está en que la transcripción de estos genes está sujeta a dos controles: represión y atenuación. La atenuación es un mecanismo que controla la habilidad de la RNA polimersa para leer, a través de un atenuador. El atenuador es un terminador intrínseco (ver figura anterior), localizado al comienzo de la unidad de transcripción. La característica que tiene es que algunos eventos externos (presencia de un metabolito, como Trp para operon trp; o un evento como la traducción) controlan la formación de la horquilla necesaria para la terminación intrínseca (Figura 10.39 Genes VII). En la atenuación al aumentar los niveles de triptófano, la transcripción se para antes: mRNA atenuado; al disminuir los niveles de triptófano, la transcripción no se para sino que continúa.

La región leader (trpL), región anterior a los genes estructurales (ver Figura 10.40 Genes VII) juega un papel fundamental en la atenuación:

La RNA polimerasa comienza la transcripción, el represor reprime poco y la RNA polimerasa transcribe un RNA correspondiente a la secuencia leader. Dependiendo de la estructura secundaria adoptada por este RNA se forma o no una señal de terminación. La secuencia leader tiene un AUG iniciador de traducción con una fase de lectura abierta hasta un UGA, señal de terminación de traducción, que da lugar a un péptido de 14 aminoácidos que no sirve para nada. A mediada que se va sintetizando el RNA leader, va adoptando una determinada estructura secundaria.

La región del RNA inmediatamente antes del sitio de terminación de la traducción (región 1), es complementaria a la región contigua (región 2) y al aparear se forma la horquilla 1-2; continúa la transcripción y se transcriben las regiones 3 y 4, que también son complementarias y forman la horquilla 3-4. Como la región 4 va seguida de una serie de Us, esto constituye una señal de terminación por lo que la transcripción cesa. Además, la región 2 puede también hibridar con la región 3. Curiosamente, en el péptido leader, de los 14 aminoácidos dos son triptófano, siendo el triptófano el aminoácido menos frecuente en las proteínas. Otra cosa a tener en cuenta es que en bacterias, a diferencia de eucarióticos, la transcripción está acoplada a traducción. Los ribosomas están traduciendo el RNA que se está transcribiendo.

Teniendo esto en cuenta:

» En ausencia de triptófano en el medio: la RNA polimerasa va transcribiendo. Los ribosomas reconocen el AUG y comienzan a sintetizar el péptido hasta que llegan a lostripletes del triptófano en los que se detienen, debido a que no hay triptofanil tRNA en el medio.Como los ribosomas quedan detenidos en el codon del triptófano, la región 1 del RNA leader queda "bloqueada"y no puede hibridar con la región 2 y se impide la formación del híbrido 1-2. Al sintetizarse la región 3, la 2 hibrida con la 3, con lo que no puede formarse el híbrido 3-4 y no se da la señal de terminación. La RNA polimerasa continúa la transcripción del operón.

» Cuando hay triptófano en el medio, los ribosomas continuamente traducen la región correspondiente al péptido leader de 14 aminoácidos. En este caso los ribosomas quedan parados en la señal de terminación de traducción (UGA) impidiendo la hibridación de la región 2 con la 3, con lo que al transcribirse la región 4 se forma el híbrido 3-4. Aparece la señal de terminación de transcripción y no se transcribe el operón.

Generalidad del mecanismo de atenuación. ¿Es un mecanismo general de control de transcripción? ¿Es sólo una peculiaridad del operón del triptófano? Si observamos diferentes péptidos leader de distintos operones de biosíntesis de aminoácidos:

» Thr: 8 tripletes de Thr.

» His: 7 tripletes de His seguidos (MTRVQFKHHHHHHHPD)

» Ile, Val, Leu (operón Ilv): 14 tripletes de Leu, Val, Ile, (MTALLRVISLVVISVVVIIIPPCGAALGRGLA)

» Operón Leu: MSHIVRFTGLLLLNAFIVRGRPVGGIQH.

La característica común en los distintos operones, es la abundancia de tripletes para ese aminoácido en su región leader. El control de atenuación no se lleva a cabo sólo por el aminoácido, sino por la biosíntesis de proteínas, ya que en ausencia de ésta la atenuación impide la síntesis del aminoácido.

Antiterminación

Los genes de los fagos no se transcriben todos a la vez. Generalmente hay un programa temporal de transcripción. Así, vimos que en SPO1 este programa se efectuaba a nivel de iniciación mediante una cascada de factores. A nivel de terminación ocurre algo análogo. Supongamos un grupo de genes A tempranos seguido de una señal de terminación TA, si un producto de uno de estos genes A es un antiterminador que hace que la RNA polimerasa se salte el terminador A, la RNA polimerasa transcribirá lo que viene a continuación (genes B) pudiendo reconocer el terminador siguiente (TB). Si el producto de un gen B es un antiterminador, la RNA polimerasa transcribe los genes siguientes a TB (genes C). Un ejemplo de este tipo de control se da el fago lambda.

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